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QuanTI-FRET, une nouvelle méthode permettant l’analyse quantitative de FRET en cellules vivantes

publié le

Le FRET, Förster Resonance Energy Transfer, est un transfert d’énergie entre deux fluorophores qui a seulement lieu lorsque ceux-ci sont à moins de 10nm l’un de l’autre. La mesure quantitative de cet effet permet de mesurer des distances de l’ordre du nanomètre avec un simple microscope de fluorescence. Si cela était possible pour des molécules isolées, la quantification du FRET était réputée quasi-impossible dans des échantillons plus complexes. Dans ce travail,une nouvelle méthode permet des mesures quantitatives de FRET en cellules vivantes. Cela ouvre la voie à une utilisation plus massive et plus aboutie des biosenseurs fluorescents.

Lors d’expériences de molécules uniques, il est possible de mesurer des distances de quelques nanomètres avec une précision inférieure au nanomètre, et cela en solution sur des molécules dynamiques. Cette prouesse est possible grâce à l’effet de FRET et grâce une méthodologie spéciale d’acquisition des photons et de l’analyse de l’origine de ces photons. L’intérêt du phénomène FRET pour sonder le vivant a crû ces dernières années avec le développement de biosenseurs fluorescents génétiquement encodés. Mais la mesure de ces sondes restait dans le meilleur des cas qualitative et sinon biaisée freinant ainsi l’essor des biosenseurs FRET pourtant très prometteurs.
En partenariat avec une équipe de l’IAB et une équipe de la LMU (Munich), une équipe du LIPhy s’est inspirée des méthodes utilisées en molécule unique pour les adapter à la microscopie de cellules vivantes. La méthode QuanTI-FRET permet de calibrer un système expérimental avec des facteurs de corrections qui sont directement mesurés mais issus d’équations photophysiques décrivant les différentes efficacités d’excitation et d’émission. Au-delà de la calibration des fuites spectrales, le cœur du calcul est effectué en une seule étape rendant la méthode QuanTI-FRET robuste. Ainsi avec un protocole de prise d’image dans trois canaux spectraux différents, on obtient une carte d’efficacité de FRET quantitative même en cellules vivantes (Fig.1). Cela a été démontré en réalisant deux campagnes de mesures complètement indépendantes, l’une à Grenoble et l’autre à Munich, et en obtenant les mêmes valeurs absolues de FRET pour des échantillons-étalons.
Avec les développements récents et l’intérêt pour les biosenseurs FRET, il devient essentiel pour les biologistes de produire des résultats quantitatifs qui puissent être directement comparés. La méthode QuanTI-FRET donne des valeurs absolues de FRET, indépendantes de l’instrument et du niveau d’expression. Grâce au calcul de la stoichiométrie relative des fluorophores, une estimation de la qualité des données est fournie, ce qui permettra à des non-spécialistes de l’utiliser avec assurance.
 

Mesures des étalons-FRET de trois distances (C5V, C17V et C32V) . Les images de fluorescence sont prises dans trois canaux spectraux et analysés par QuanTI-FRET résultant en une carte de FRET quantitative. Barre d’échelle 20µm.
 
 
 

Voir en ligne : QuanTi-FRET : a framework for quantitative fRet measurements in living cells, A. Coullomb, C. M. Bidan, C. Qian, F. Wehnekamp, C. Oddou, C. Albigès-Rizo, D.Lamb & A. Dupont, Sci. Rep. April 2020