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Combiner les fluctuations de la fluorescence et le photoblanchiment pour quantifier la densité de surface

publié le

La spectroscopie par fluctuations de fluorescence (FFS) est une technique assez répandue qui sert à évaluer des densités ou concentration de molécules, d’agrégats ou de particules dans des environnements biologiques (cellules, solutions, surfaces). En réalité, lorsque les espèces d’intérêt ne sont pas marquées en fluorescence de manière uniforme, ces techniques ne donnent pas de résultats quantitatifs. Nous avons donc proposé de combiner la FFS avec le photoblanchiment et avons démontré théoriquement que, quelle que soit la distribution initiale des marqueurs fluorescents individuels sur les entités à compter, la brillance (mesurée par FFS) décroît toujours linéairement, fournissant ainsi deux résultats : la brillance des marqueurs fluorescents individuels et un paramètre dépendant de la moyenne et de la variance de la distribution de ces marqueurs sur les entités à compter. Nous avons expérimentalement démontré cette nouvelle méthode en utilisant une monocouche de streptavidines (faisant office de base d’accueil pour des échantillons biomimétiques) pour estimer la densité de surface de streptavidines, puis celle de molécules de biotines qui viennent s’y lier. La densité de la monocouche de streptavidine estimée avec notre nouvelle méthode s’avère en excellent accord avec des mesures, totalement indépendantes, par spectroscopie ellipsométrique.


Nous présentons une nouvelle méthode, auto-calibrée et appelée pbFFS (pour photobleaching fluctuation fluorescence spectroscopy) dont l’objectif est de caractériser des molécules ou des particules marquées avec une distribution inconnue de fluorophores. Grâce au photoblanchiment, qui joue le rôle d’un paramètre de contrôle, la méthode pbFFS fournit des informations sur la distribution des marqueurs fluorescents et une estimation fiable de la densité ou de la concentration absolue des molécules d’intérêt. Nous faisons la démonstration théorique complète du principe de la méthode pbFFS et la mettons également en œuvre pour mesurer la densité de surface d’une monocouche de molécules de streptavidine, marquées en fluorescence et qui est utilisée comme couche de base pour élaborer des systèmes biomimétiques. La densité de surface mesurée par pbFFS est cohérente avec les résultats de l’ellipsométrie spectroscopique, une technique classique pour les surfaces. Cependant, la pbFFS présente deux avantages principaux : elle permet une caractérisation in situ (aucun substrat dédié n’est nécessaire) et peut être appliquée à de faibles masses de molécules adsorbées, ce que nous démontrons ici en quantifiant la densité de molécules de biotine-Atto qui se lient à la couche de streptavidines. Enfin, nous avons également appliqué le pbFFS à des molécules diffusant en solution, afin de confirmer la distribution des marqueurs fluorescents présents trouvée en surface. En conclusion, le pbFFS fournit tout un ensemble d’outils pour étudier les molécules marquées avec un nombre variable de fluorophores, dans le but de quantifier soit le nombre de molécules, soit la distribution des marqueurs fluorescents, ce dernier cas étant particulièrement pertinent pour les études d’oligomérisation.

Contact : antoine.delon@univ-grenoble-alpes.fr

Voir en ligne : Combining Fluorescence Fluctuations and Photobleaching to Quantify Surface Density” Julius Sefkow-Werner, Elisa Migliorini, Catherine Picart, Dwiria Wahyuni, Irène Wang, and Antoine Delon Anal. Chem.