Nous présentons une nouvelle méthode, auto-calibrée et appelée pbFFS (pour photobleaching fluctuation fluorescence spectroscopy) dont l’objectif est de caractériser des molécules ou des particules marquées avec une distribution inconnue de fluorophores. Grâce au photoblanchiment, qui joue le rôle d’un paramètre de contrôle, la méthode pbFFS fournit des informations sur la distribution des marqueurs fluorescents et une estimation fiable de la densité ou de la concentration absolue des molécules d’intérêt. Nous faisons la démonstration théorique complète du principe de la méthode pbFFS et la mettons également en œuvre pour mesurer la densité de surface d’une monocouche de molécules de streptavidine, marquées en fluorescence et qui est utilisée comme couche de base pour élaborer des systèmes biomimétiques. La densité de surface mesurée par pbFFS est cohérente avec les résultats de l’ellipsométrie spectroscopique, une technique classique pour les surfaces. Cependant, la pbFFS présente deux avantages principaux : elle permet une caractérisation in situ (aucun substrat dédié n’est nécessaire) et peut être appliquée à de faibles masses de molécules adsorbées, ce que nous démontrons ici en quantifiant la densité de molécules de biotine-Atto qui se lient à la couche de streptavidines. Enfin, nous avons également appliqué le pbFFS à des molécules diffusant en solution, afin de confirmer la distribution des marqueurs fluorescents présents trouvée en surface. En conclusion, le pbFFS fournit tout un ensemble d’outils pour étudier les molécules marquées avec un nombre variable de fluorophores, dans le but de quantifier soit le nombre de molécules, soit la distribution des marqueurs fluorescents, ce dernier cas étant particulièrement pertinent pour les études d’oligomérisation.
Contact : antoine.delon@univ-grenoble-alpes.fr